Confirmação laboratorial:

Confirmação laboratorial: 

A investigação laboratorial mais importante é a do hematócrito serial e o hemograma completo. Estas investigações devem ser facilmente acessíveis a partir do centro de saúde. Os resultados devem estar disponíveis no mais tardar dentro de duas horas em casos graves de dengue. Se não houver serviços de laboratório adequados que esteja disponível algo deve ser feito de imediato. a) Exames inespecíficos: Hematócrito, hemoglobina, plaquetas é leucograma. 
Recomendado para pacientes que se enquadrem nas seguintes situações: gestantes; idosos (>65 anos); hipertensão arterial, diabete melito, DPOC, doenças hematológicas crônicas (principalmente anemia falciforme), doença renal crônica, doença severa do sistema cardiovascular, doença ácido-péptica e doenças auto-imunes. Realizar a coleta no mesmo dia e o resultado em até 24 horas. Sem falar é obvio dos casos suspeitos que apresentem algum sintoma do dengue. 
b) Exames específicos: A confirmação laboratorial é orientada de acordo com a situação epidemiológica, em períodos não epidêmicos: solicitar o exame em todos os casos suspeitos; em períodos epidêmicos: solicitar o exame conforme a orientação da vigilância epidemiológica; solicitar sempre nas seguintes situações: Gestantes (diagnóstico diferencial com rubéola).

Diagnóstico sorológico:
a) Método de escolha para o diagnóstico da dengue;
b) Detecta anticorpos antidengue;
c) Coleta a partir do sexto dia do início dos sintomas;
d) A técnica disponível nos laboratórios centrais do país é o ELISA;
e) Outras técnicas como Inibição de hemaglutinação, teste neutralização não são utilizadas na rotina.
Diagnóstico por detecção de vírus ou antígenos virais
a) Isolamento viral: seu uso deve ser orientado pela vigilância epidemiológica com o objetivo de monitorar os sorotipos circulantes;
b) Coleta até o quinto dia de início dos sintomas;
c) Detecção de antígenos virais pela Imunohistoquímica de tecidos;
d) Diagnóstico molecular feito pelo RT-PCR.

Achados laboratoriais inespecíficos que acompanham o quadro do dengue são: • Leucopenia e linfopenia. Linfocitose atípica pode ocorrer. • Trombocitopenia. • Diminuição da albumina. Albuminúria. • Alteração discreta da função hepática. • Na forma hemorrágica: concentração do hematócrito (aumento de 20% em relação ao basal), trombocitopenia (100.000/mm3), aumento do TP e PTT, diminuição do fibrinogênio, protrombina, fator VIII, fator XII, antitrombina e alfaantiplasmina. O diagnóstico de dengue requer isolamento do vírus, se pode indicar o isolamento viral PCR durante os primeiros 3 a 4 dias de iniciados os sintomas. Ou detecção de anticorpos específicos no soro do paciente. Em casos graves, a coleta de hemocultura para diagnóstico diferencial, bem como de rotina do líquor, na presença de meningismo, é aconselhável.

1.1. Isolamento viral

É o método mais específico para a determinação do arbovírus responsável pela infecção. O período médio de viremia é de seis dias. O uso de células de mosquito permite elevada sensibilidade, sendo o mais utilizado para isolamento viral. O soro do paciente deve ser congelado a menos 70 ºC. Devido à sua complexidade técnica, o uso desse método se restringe a laboratórios de pesquisa. Pode ser realizada em fragmentos de tecidos (vísceras) em caso de óbitos.

Como é a infecção por dengue confirmada?

A possibilidade de realizar a cultura e isolamento do vírus da dengue a partir do sangue do paciente durante a fase febril está disponível. Este método ainda é a regra de ouro, mas é caro e difícil, razão pela qual não é aplicável à maioria dos pacientes. Além disso, os laboratórios de virologia qualificada para executar a cultura e isolamento são escassos, e a aplicação de técnicas de biologia molecular para detecção do genoma viral é mais viável. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada para identificar o sorotipo viral e a carga viral, bem como, neste caso por meio do chamado PCR em tempo real (Guzmán & Kourí, 2004). Até agora, estes são os métodos mais confiáveis, embora não sejam as mais frequentemente utilizadas.

1.2. Sorologia

Cinco métodos são classicamente descritos para diagnóstico sorológico de infecções pelo vírus dengue:

(1) Inibição de Hemoaglutinação;

(2) Fixação de complemento;

(3) Teste de neutralização;

(4) Imunoensaio enzimático (ELISA) IgM;

(5) Imunoensaio enzimático (ELISA) IgG.

A Inibição de Hemoaglutinação, Fixação de complemento e Teste de neutralização, necessitam para diagnóstico sorológico um aumento significativo (maior que 4x) dos títulos entre fase aguda e convalescença (amostras pareadas) (2-3-4). Desta forma, na rotina laboratorial, o imunoensaio enzimático se tornou o método mais utilizado, tendo em vista a sua praticidade e bom desempenho em relação às demais metodologias.

1.3. Imunoensaio enzimático IgM

Baseia-se na detecção de anticorpos IgM específicos para os quatro sorotipos. Detecta anticorpos anti-IgM em 80% dos pacientes com 5 dias de doença; 93% dos pacientes com 6 a 10 dias de doença e 99% entre 10 e 20 dias. Alguns pacientes podem não desenvolver IgM com 7 ou 8 dias de doença. O IgM é detectado na infecção primária e na infecção secundária, com títulos mais altos na primeira. Dengue reatividade cruzada, já uma pequena porcentagem de pacientes com infecção secundária não têm IgM detectável. Na infecção terciária os títulos são mais baixos ou ausentes. Em alguns casos de infecção primária, IgM pode persistir por mais de 90 dias, mas na maioria é indetectável após 60 dias do início do quadro clínico (3). Estudo em Porto Rico evidenciou índice de falso-positivo de 1,7% para ELISA IgM. Lembramos que causa comum de falso-negativo é a coleta prematura da amostra (antes do 5º dia) (3). Reações cruzadas com outras flaviviroses são citadas para ELISA IgM (11). O método de IgM captura tem sensibilidade de 92% e especificidade acima de 99% (1). Do acima exposto, deve-se considerar que amostras positivas de IgM não são diagnóstico definitivo de infecção atual pelo vírus dengue, devendo ser interpretadas como dengue provável. Quando a confirmação for relevante, o diagnóstico de certeza requererá métodos de isolamento viral como a cultura em células de mosquito ou através de pesquisa do genoma do vírus (PCR) (2,3,4,5).

1.4. Imunoensaio enzimático IgG

Anticorpos IgG na dengue são menos específicos que o IgM, havendo possibilidade dereações cruzadas entre as flaviviroses, o que acarreta em altas taxas de falso-positivos (3,11,13). Em sorologias pareadas, têm sensibilidade semelhante à Hemoaglutinação (14). Deve-se lembrar da possibilidade de transferência vertical de IgG materna à crianças, e da ocorrência de IgG positivo em pacientes vacinados contra febre amarela (16). Ressalta-se que a combinação de ELISA IgM e IgG é importante para o diagnóstico do dengue em pacientes em áreas endêmicas, pois parte de enfermos reinfectados podem não apresentar elevações de IgM. Deve ser realizado a partir do 13a dia.

1.5. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e genotipagem

É um método sensível e reprodutível que apresenta em relação ao isolamento viral a vantagem da maior facilidade técnica e rapidez. A PCR se encontra positiva antes da sorologia, permanecendo positiva durante o período de viremia (até sete dias após o início do quadro clínico). Permite a genotipagem, com definição do sorotipo do vírus da dengue (DEN 1, 2, 3, 4) através da utilização de iniciadores específicos (3,7,18). Como o vírus da dengue é termolábil, a imediata congelação da amostra, após a coleta, é necessária. A sensibilidade e especificidade do método variam de acordo com o protocolo utilizado, com sensibilidade variando de 92 a 100% (3,7,18,19,20,21,22,23). Thayan e colaboradores, utilizando PCR aninhada (Nested-PCR) encontraram eficácia superior ao isolamento viral, com sensibilidade de 100% (23).

Sugestivo de Dengue:

Um dos seguintes:
1. IgM + em uma única amostra de soro
2. IgG + em uma única amostra de soro com um título de HI de 1280 ou superior
3. + PCR e HI título inferior a 1280.

Dengue confirmado:

Um dos seguintes:
1. PCR + e título IH superior a 1280 + ou IgM
2. Vírus + cultura
3. IgM soroconversão de soros pareados
4. Soroconversão de IgG em soros pareados, ou aumento de quatro vezes no título IH.